做过蛋白质印迹实验的小伙伴们都知道，封闭试剂的选择取决于蛋白质印迹检测步骤中使用的二抗的种类。这期的主题是JacksonImmunoResearch公司为大家讲解：如何选择合适的封闭试剂？以及孵化时间和洗涤。

一、Jackson公司选择合适的封闭试剂：

蛋白封闭剂

封闭溶液的蛋白质成分应与被检测的抗原和二抗的种类相容。

牛血清白蛋白(BSA)和脱脂奶粉通常用于封闭溶液，因为它们既便宜又容易获得。然而，它们并不总是合适的，并且可能是背景的原因。

当使用针对来自牛或相关物种（如羊驼、山羊、马或绵羊）的抗体的抗体时，应避免使用BSA和脱脂奶粉。在许多BSA制剂中发现低水平的牛免疫球蛋白G(IgG)。

建议使用来自标记二抗宿主物种的正常血清作为最佳封闭剂，以避免任何不必要的相互作用。使用前应制备新鲜的血清工作溶液，通常在浸入膜之前在所选缓冲液中稀释至5%w/v。

缓冲溶液

通常使用pH范围高于大多数抗体（pH范围7.5-8.5）的等电点(pI)的缓冲溶液，例如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。如果磷酸化蛋白是印迹的焦点，则不推荐使用PBS。

这是因为一抗可以与缓冲液中的磷酸盐以及靶蛋白结合。还应考虑缓冲液pH值对检测步骤中使用的报告酶（例如碱性磷酸酶）活性的影响。

非离子洗涤剂

非离子去污剂通常包含在蛋白质印迹中使用的缓冲液中。它们可以防止聚集，这本身会导致背景，但也可以绑定到可能导致非特定交互的任何站点。

Tween-20（通常为0.1%）通常用作缓冲添加剂。

二、Jackson公司孵化时间和洗涤

应确定实现最佳信噪比所需的最短可能阻塞持续时间。虽然在4°C下过夜封闭可能很有吸引力，但过度封闭孵育会导致聚集和细菌生长，这可能会导致背景或干扰可视化。

封闭过程可能需要通过改变组分及其浓度、时间和温度来进行优化，以获得最低的背景和最高的信噪比。

值得注意的是，在封闭后用不含其蛋白质成分的缓冲液清洗膜很重要，因为它可以改善一抗对抗原表位的访问。（表1）

注意：专有的阻塞解决方案

有几种预配制的封闭溶液可供使用，它们在市场上销售时适用于所有实验条件。情况可能并非总是如此，尽管它们可能足以满足一组条件。重要的是要考虑后续试剂的种类可能会排除使用通用封闭溶液，并且使用标记抗体种类的正常血清可能更可靠。

注意：用BSA或牛奶封闭

牛血清白蛋白(BSA)和奶粉可能含有牛IgG。抗羊驼、抗牛、抗山羊、抗马和抗羊抗体会与牛IgG发生反应。使用BSA或奶粉进行封闭或稀释可能会显着增加背景和/或降低抗体滴度，应避免使用具有这些特异性的抗体；使用标记二抗宿主物种的正常血清(5%v/v)。如果BSA被视为封闭剂，请使用不含IgG的试剂以降低背景电位。（表2）