免疫组化染色实验步骤

免疫组织化学技术(IHC)现在发展的已经很成熟了，应用范围也比较广泛，涉及到各个学科，也是临床医学专业的需要掌握的基础技术之一。免疫组化是应用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。是临床病理诊断与科学研究中必不可少的一种方法，其中石蜡组织的免疫组化染色是最常用的技术。

Note！脱蜡前将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2~3小时

1)置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中浸泡10分钟，在二甲苯III中浸泡10分钟，在二甲苯Ⅳ中浸泡10分钟；

2)无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟；

3)95%乙醇中浸泡5分钟；

4)85%乙醇中浸泡5分钟；

5)70%乙醇中浸泡5分钟；

6)蒸馏水中浸泡5分钟；

A、高温高压热修复(酸性修复条件为例)

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气，从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后，用PBS洗5分钟。

B、微波热修复(酸性修复条件为例)

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中中，高档继续处理10-15分钟，取出微波盒冷却至室温，取出玻片先用蒸馏水洗两次，后用PBS洗5分钟。

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶，使用前酶预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间为10-30分钟

1)脱蜡水化；

2)PBS洗3次，各6分钟；

3)抗原修复；

4)用蒸馏水配置新鲜的3%H2O2-甲醇室温封闭10分钟；

5)PBS洗3次，各6分钟；

6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟；

7)甩去多余液体滴加一抗4℃过夜；

8)37℃复温45分钟；

9)PBS洗3次，各8分钟；

10)滴加二抗，室温30分钟；

11)PBS洗3次，各8分钟；

12)DAB显色10分钟在显微镜下掌握染色程度；

13)蒸馏水洗终止染色；

14)苏木素复染，盐酸酒精分化；

15)脱水透明封片镜检；

主要事项：

Note!上述冲洗步骤切勿直接对着组织冲洗，冲洗时力度要适中，以免组织芯片掉片。

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