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免疫组化染色实验步骤
免疫组织化学技术(IHC)现在发展的已经很成熟了,应用范围也比较广泛,涉及到各个学科,也是临床医学专业的需要掌握的基础技术之一。免疫组化是应用抗原和抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对其进行定位、定性及定量的研究。是临床病理诊断与科学研究中必不可少的一种方法,其中石蜡组织的免疫组化染色是最常用的技术。
一、脱蜡和水化Note!脱蜡前将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2~3小时
1)置于二甲苯I中浸泡10分钟,在二甲苯II中浸泡10分钟,在二甲苯III中浸泡10分钟,在二甲苯Ⅳ中浸泡10分钟;
2)无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟;
3)95%乙醇中浸泡5分钟;
4)85%乙醇中浸泡5分钟;
5)70%乙醇中浸泡5分钟;
6)蒸馏水中浸泡5分钟;
抗原热修复A、高温高压热修复(酸性修复条件为例)
取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气,从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源,冷却至室温,取出玻片,先用蒸馏水洗两次后,用PBS洗5分钟。
B、微波热修复(酸性修复条件为例)
取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中中,高档继续处理10-15分钟,取出微波盒冷却至室温,取出玻片先用蒸馏水洗两次,后用PBS洗5分钟。
酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶,使用前酶预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间为10-30分钟
二、免疫组化(IHC)染色1)脱蜡水化;
2)PBS洗3次,各6分钟;
3)抗原修复;
4)用蒸馏水配置新鲜的3%H2O2-甲醇室温封闭10分钟;
5)PBS洗3次,各6分钟;
6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟;
7)甩去多余液体滴加一抗4℃过夜;
8)37℃复温45分钟;
9)PBS洗3次,各8分钟;
10)滴加二抗,室温30分钟;
11)PBS洗3次,各8分钟;
12)DAB显色10分钟在显微镜下掌握染色程度;
13)蒸馏水洗终止染色;
14)苏木素复染,盐酸酒精分化;
15)脱水透明封片镜检;
主要事项:
Note!上述冲洗步骤切勿直接对着组织冲洗,冲洗时力度要适中,以免组织芯片掉片。
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