通用名称：胰岛细胞自身抗体检测试剂盒（酶联免疫法）

英文名称：ICAELISA

96T

本试剂盒可用于定性检测人血清样本中针对胰岛细胞抗原的IgG类抗体。

胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）是一种使人衰弱的慢性疾病，它会损害关键激素胰岛素的产生和分泌，并改变血糖代谢。胰岛素是由胰岛细胞或朗格汉斯岛的胰岛合成和分泌的。胰岛素合成的中断是由IDDM患者的自身抗体对胰岛细胞的免疫破坏引起的。这种异常（自身免疫）可能是遗传的和/或由暴露于有毒化学物质、病毒感染和各种形式的压力引起的。

IDDM具有特征性的无症状糖尿病前期期，可持续数年。在此期间，患者在静脉/口服葡萄糖挑战时表现出早期胰岛素释放减少。在大多数情况下，这些人携带循环中的胰岛细胞自身抗体（ICA）和/或胰岛素自身抗体（IAA）。ICA早在IDDM临床发病前8年被检测到，因此可以作为疾病或易感性的早期指标。ICA阳性的个体可能显示胰岛细胞功能的进行性丧失，这表明早期胰岛素释放的中断。当早期胰岛素释放完全停止时，临床上会出现明显的IDDM。

胰岛细胞自身抗体存在于70%的近期IDDM患者中，而对照组非糖尿病人群中为0.1-0.5%。在IDDM患者的一级亲属中也可检测到ICA。这些个体构成了患IDDM的高危人群。一些研究报道，IDDM患者的ICA阳性的一级亲属随后发展为糖尿病。其他研究也表明，血清ICA和IAA的存在是IDDM发生可能性增强的一个指标。因此，ICA的血清学检测可能是早期诊断IDDM的有力工具。这些自身抗体作为IDDM标记物的意义也可以在最终发展为IDDM的非糖尿病个体中得到说明。Riley等人最近报道，2型糖尿病患者中ICA的测定可以在临床症状出现之前识别IDDM，并预测胰岛素治疗的需要。因此，那些最初诊断为2型糖尿病并携带血清ICA的患者可能会恶化为胰岛素依赖。

早期发现循环ICA对于识别一般人群中的个体、IDDM患者的兄弟姐妹和家庭非常重要，他们由于遗传易患糖尿病，患这种疾病的风险更高。在一个关于ICA的国际研讨会上，我们强调了迫切需要进行ELISA检测来确定胰岛细胞自身免疫。

目前，在筛查IDDM患者时，血清ICA是通过间接免疫荧光和组织化学方法来确定的，以冷冻的非固定的人/灵长类或啮齿动物胰腺切片作为底物。尽管自年最初的描述以来，人们试图改进和修改这一程序，但间接免疫荧光/组织化学技术存在固有的方法问题。该技术的标准化已被证明是非常困难的。这种“冷冻切片”技术的可靠性受到一些因素的限制，如从一个胰腺到另一个胰腺的变化，不可避免的对不固定的胰腺组织的需要，以及很少能获得合适的组织。

将一种纯化的胰腺抗原固定在微孔板上，在孵育期间，血清样本中的抗体与微孔板上的抗原分子在室温下反应。洗涤除去多余/未结合的血清材料后，加入酶（碱性磷酸酶）标记的山羊抗体，对人IgG特异，与抗原-抗体复合物反应。再次洗涤后，加入底物液（PNPP），通过分光光度计测量颜色强度。颜色的强度与样本中的ICA浓度成正比，其阳性质控作为内部质量控制，可保证实验结果的有效性。

1）微孔板：12x8

2）酶联物：2x1mL，6倍浓缩，酶-IgG共轭物

3）样本稀释液：1x25mL，5倍浓缩

4）酶联物稀释液：1x10mL

5）参考质控品：1x1.5mL

6）阳性质控品：1x1.5mL，人血清

7）阴性质控品：1x1.5mL，人血清

8）底物液：1x15mL，PNPP

9）终止液：1x6mL，即用型

10）洗涤缓冲液：25倍浓缩，1x20mL

所需材料（未提供）

1．蒸馏水或去离子水

2．吸水纸、封板纸

3．适当的玻璃试管

4．微量移液器及一次性吸头：10、50、μL

5．5mL移液管

6．mL量筒

7．酶标仪（nm）

8．塑料标签带

当怀疑患者有IDDM的风险,可以胰岛细胞自身抗体辅助判断，样品采集时，通过静脉穿刺收集5-10mL血液至凝集管中（红盖），通过离心分离血清，该血清可用于检测

血清样本应储存在2-8℃下

过多溶血及出现大凝块或微生物生长的样本可能会干扰检测的性能

若样本不能在24小时内进行检测，则应在-20℃下冷冻储存

酶联物

将5mL酶联物稀释液加入含有酶联物（浓缩物）的瓶子中，拧紧盖子并立即颠倒混匀

稀释后的酶联物未使用时储存在2-8℃下，标记重建日期

重建后的酶联物稀释液的有效期为30天

试剂盒提供了两瓶酶联物浓缩物，每瓶含有足够6条微孔板使用的酶联物体积，根据需要进行重建

样本稀释缓冲液

若由于在低温如2-8℃下储存，样本稀释缓冲液浓缩物中出现沉淀物，则可通过在37℃水浴锅中加热30分钟使其溶解

在适当的容器中，25mL样本稀释缓冲液浓缩物+mL蒸馏水或去离子水，混匀，稀释后的样本稀释缓冲液在2-8℃下可储存至有效期

请注意，浓缩物中出现沉淀物并不影响试验，且在1x工作液中是不会出现的

洗涤液

若由于在低温如2-8℃下储存时浓缩物中会出现沉淀物，则可通过在37℃水浴锅中加热30分钟使其溶解

在适当的容器中，将全部洗涤浓缩液加入mL蒸馏水或去离子水，混匀，稀释后的洗涤缓冲液在2-8℃下可储存至有效期

血清样本制备

在玻璃管中制备，10μL血清+1.0mL样本稀释缓冲液工作液，混匀

检测前，将所有试剂包括血清样本平衡至室温（25℃），孵育温度差异只能在±1℃下，建议进行双孔检测

1)取出所需数量的微孔板并固定在支架上

2)取A1和B1孔作为空白对照

3)将μL质控品和稀释后的样本加入相应的孔中

4)封板，在室温下孵育1小时

5)弃去孔中内容物，每孔加入μL洗涤液洗涤3次，结束后在吸水纸上拍打微孔板以除去残留液体

6)将μL酶联物加入每个孔中，除了空白孔

7)封板，在室温下孵育1小时

8)重复洗涤步骤

9)将μL底物液加入每个孔中，包括及空白孔

10)封板，在室温下避光孵育30分钟

11)将50μL终止液加入每个孔中

12)用空白孔调零酶标仪后读取nm处的吸光度

1.分别计算质控品和样本的平均吸光度值

Rm：参考质控品平均吸光度值

Nm：阴性质控品平均吸光度值

Pm：阳性质控品平均吸光度值

Sm：样本平均吸光度值

2.分别计算Rm与样本及质控品的比值，通过该比值判断结果。

这种体外试验程序检测疑似IDDM的患者血清中ICA抗体的存在。但是仅使用此方法获得的结果不能用于诊断结论。因为这只是一个筛选测试。IDDM的诊断应根据患者的病史、临床症状和其他检测结果的数据进行。

保存弱阳性和边缘样品（在参考对照的5%以内），并存储在-20°C。来自这些患者的新鲜样本应每六个月与以前的血清样本一起再次进行一次检测。

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