透射电镜与扫描电镜样本制备过程中的问题和解决方案

一、胶体金颗粒没有结合上是什么原因？如何避免？[1]

原因：造成这种现象可能是由于抗原的量低；抗体由于滴度低、储存不当或年限较长、稀释不当或过度冷冻和解冻等原因导致的质量问题；溶液的pH值可能过高或呈碱性；严重的阴性染色可能会掩盖金颗粒。

改善方法：使用更长的孵育时间和更浓缩的初级抗体，还可以通过调节pH或降低负染料的浓度和/使用较大的金颗粒来改善这种情况。

二、电子显微镜检查时涂层不稳定的原因？如何避免？[2]

原因：由于电子束与薄膜和样品的相互作用而引起的薄膜加热。改善方法：随着时间的推移，当电子束穿过栅格时，通过缓慢增加电子束的强度来稳定薄膜；使用真空蒸发器在格栅上再涂一层直接碳。

三、背景金颗粒过多的原因？如何避免？[2]

（1）如果是在塑料薄膜上，则该部分可能没有暴露在溶液中（由于侧面朝上），因此在转移和清洗格栅时要小心，将装有样品的格栅面朝上；（2）抗原在制备过程中受到破坏，使用不同的程序在1%多聚甲醛中进行短链反应；（3）溶液的离子浓度可能很低，提高盐浓度（高达2.5%）。在孵育溶液中添加卵清蛋白、BSA或正常山羊血清（不适用于蛋白A）至约1%。（4）在孵育期间，切片可能没有被充分清洗，增加洗涤步骤；（5）抗体的非特异性电荷吸引可引起背景，在所有溶液中使用1%的洗涤剂（例如，Tween20）。在所有溶液中加入正常山羊血清（不含蛋白A），一抗培养前正常山羊血清浓度增高。

四、金颗粒发生聚集的原因？如何避免？[3]

原因：一抗混杂，形成团块；聚集可能是由金共轭物的自然放大因子引起。对于IgG-金颗粒偶联物，多达10个偶联金颗粒可以附着在一抗的Fc组分上，在切片上产生团簇的外观，但这种情况一般不会发生在蛋白偶联物上。改善方法：使用新鲜的抗血清；如有需要，可使用更高稀释度的金颗粒。

五、染色密度太大，无法辨别结构细节怎么办？[4]

原因：网格上的污渍太多了；染色浓度过高；调整瞬变电磁加速电压。改善方法：滤纸吸附去除污渍，然后在染色过程中去除网格；降低染色浓度；增加加速电压可以降低图像对比度。

六、样品不均匀地分散在网格上怎么办？[4]

因为有支撑膜的栅格往往是疏水的，可以使用润湿剂使网格更疏水；滴入细菌肽（50μg/ml）、poly-L-赖氨酸（1μg/ml）或牛血清白蛋白（0.05%至0.%w/v）孵育30-60秒；还可以直接将润湿剂添加到样品中以帮助扩散。

七、样本固定剂有哪些种类？[5]

戊二醛是一种五碳双醛，它有用性质是能交联蛋白质。新鲜制备的葡二醛在中性pH下也会聚合成长链二醛，它提供可变大小的交联，有效地稳定蛋白质结构。多聚甲醛通常与戊二醛结合，以更好地稳定生物样品。一般来说，当固定剂被鉴定为含有多聚甲醛时，通常意味着它们含有由甲醛的多聚甲醛聚合物产生的甲醛。这种新制备的一碳一醛甲醛在水溶液中反应为亚甲基乙二醇，其优点是其快速渗透特性和聚合和交联蛋白质和核酸的能力，也可以改变脂类的化学性质。丙烯醛是另一种高活性固定剂，通常与其他醛(如戊二醛和/或多聚甲醛)结合使用，用于固定非常致密的样品。

八．透射电镜样本分为哪几种类型？[5]

（1）固体粉末样本：将粒径符合要求的粉末溶解在有机溶剂无水乙醇中，用超声的方法将样品尽可能地分散开，然后用支持网捞起来；（2）大部分的TEM样本是薄膜类的样本，该类样本可以做静态观察，如样本组织内部结构分布，密度，状态等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用。（3）金属类的样本的表面复型，即把需要观察的金属样本的表面形貌（表面显微组织的凹凸情况）用适宜的非晶薄膜复制出来，再对金属样本表面形貌的复制膜进行透射电镜观察与分析，以观察样本组织，断口的外形，表面凹凸情况及磨损程度，二维的形态和分布、及结构分析。

[1]YongchangC,FengweiW.InvestigationofProliferationandDifferentiationofGastricEpithelialCellsofFetalratbyElectronicMicroscopeandImmunohistochemicalMethods[J].JOURNALOFZHENJIANGMEDICALCOLLEGE,.

[2]McleanIW,NakanePK.Anewfixativeforimmunoelectronmicroscopy[J].ArchivesofPathologyLaboratoryMedicine,,:-.

[3]Tremblay,Marie-éve,RiadM,MajewskaA.PreparationofMouseBrainTissueforImmunoelectronMicroscopy[J].JVisExp,(41).DOI:10./.

[4]GriffithsG,SimonsK,WarrenG,etal.Immunoelectronmicroscopyusingthin,frozensections:applicationtostudiesoftheintracellulartransportofSemlikiForestvirusspikeglycoproteins.[J].MethodsinEnzymology,,96:-.DOI:10./S-(83)-X.

[5]Stefan,Geimer,Michael,etal.CentrinscaffoldinChlamydomonasreinhardtiirevealedbyimmunoelectronmicroscopy.[J].Eukaryoticcell,2.

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