多重免疫分析具有许多优点，如可以从每个样本中获取更多的生物信息，更高的通量以及（在许多情况下）降低成本。多标实验还通过在相同的实验条件下同时测量所有分析物来消除其他变量的影响，例如测定温度，缓冲液系统和操作员。开发多重免疫测定的主要挑战是不同分析物的浓度和表达模式可能会有很大差异。这可以通过仔细的实验设计来解决。

1.了解样本信息为了使多重免疫测定生成可靠的数据，必须对其进行配置以确保准确检测所讨论的每种分析物。分析物的丰度和表达位置可能不同；虽然有些分析物是细胞内的，但其他分析物在细胞表面表达或作为分泌的生物分子表达。在某些情况下，可能需要刺激分析物表达（例如，通过与生长因子一起孵育）或鉴定特定的蛋白质亚型。UniProt和PAXdb等开放获取资源提供有关蛋白质丰度，已知异构体和翻译后修饰（PTM）的信息，而出版物和抗体数据表是其他有用的资源。

2.考虑所需的多路复用级别多重免疫测定的复杂性范围很广，包括靶蛋白的蛋白质印迹检测和同一膜上的上样物对照，通过对组织切片中3或4种不同蛋白质的免疫组化（IHC）分析，到基于流式细胞术检测由单个细胞表达的多达20种不同的分析物。使用基于磁珠的检测或抗体阵列，可以同时监测数百个生物分子。作为一般规则，对特定分析物的了解越少，所需的多重检测水平就越高;虽然检测尽可能多的靶标可能很诱人，但分析物的数量应与每次测试的成本以及测定开发和验证所涉及的工作量相平衡。

3.鉴定合适的分析物特异性抗体分析物特异性抗体是多重免疫测定的关键成分，应谨慎选择。首先，应针对预期应用对其进行验证，抗体制造商的数据表为抗体性能提供支持证据。同样重要的是需要滴定抗体以鉴定可接受的信号窗口;这包括分析物特异性抗体和将用于检测的任何二抗。单克隆抗体具有批次间性能一致和保证长期供应的优势。然而，由于多克隆可以通过识别几种表位来提供信号放大，因此它们可以成为检测稀有分析物的首选。通常的做法是在同一实验中将单克隆和多克隆抗体组合在一起以进行多重检测。

4.选择兼容的二抗除非可与酶或荧光团偶联分析物特异性抗体，否则二抗是实现靶标检测的必需试剂。重要的是，二抗可以提供信号扩增，这意味着它们通常被纳入多重免疫测定工作流程中，以确保检测低丰度靶标。在选择二抗试剂时，确认它们与分析物特异性抗体相容至关重要-例如，山羊抗兔二级试剂将用于检测在兔宿主中培养的分析物特异性抗体。亚类特异性二抗提供了并行使用来自同一宿主物种的几种抗体的灵活性，前提是它们的特异性已得到制造商的确认，而交叉吸附的二抗（MinX）可最大限度地减少物种交叉反应性，这可能是不需要的背景信号的来源。当其他一抗选项不可用时，也有标记来自同一宿主物种的两种一抗的策略。

5.确定是否需要额外的信号放大虽然多克隆分析物特异性抗体和二抗试剂都提供信号扩增，但有时可能需要进一步增强测定信号。一种流行的方法是使用标记的链霉亲和素-生物素（LSAB）信号扩增，即在加入标记的链霉亲和素进行检测之前，分析物特异性抗体被生物素化的二抗结合。在这种情况下，信号放大是通过1）多个生物素附着在每个二抗上和2）链霉亲和素的四聚体性质来实现的，其每个分子具有四个生物素结合位点，增加了亲和力。

6.使用在线工具在大多数情况下，多重免疫测定依赖于荧光读数（免疫印迹是一个例外，其中化学发光检测可用于同时可视化具有不同分子量的两个条带），并且建议将明亮的荧光团与稀有靶标配对，反之亦然。随着靶标分析物数量的增加，实验设计变得越来越具有挑战性，特别是对于流式细胞术，在同一实验中可以检测到多达20种不同的生物分子。SpectraViewer等在线工具通过提供荧光团激发和发射光谱的可视化来简化面板设计，从而快速评估荧光团兼容性。

7.记得确认批次间的一致性多重免疫测定涉及使用广泛的抗体选择，随着时间的推移，每种抗体将包含不同的批次。建议研究人员在每次购买新批次时测试抗体性能-包括分析物特异性抗体和二抗试剂-以确保可重复的结果。对于涉及大量样品的研究，或那些将在较长时间内进行的研究，直接从制造商处购买（或保留）大量抗体试剂可能是明智的。

8.始终包括适当的控制质控品对于任何免疫测定都是必不可少的，它们用于监测测定性能和验证结果。阳性对照产生最大的测定信号，而阴性对照提供非特异性结合的指示;两者都应包含在每个免疫测定中，无论检测到的不同靶标的数量如何。其他类型的对照包括仅二抗对照，旨在评估在没有分析物特异性抗体的情况下的二抗结合;补偿对照，用于通过用单个荧光团染色样品来评估流式细胞术中的光谱重叠;和同种型对照（包含与分析物特异性抗体具有相同同种型和浓度但不能识别靶标的抗体），用于IHC和流式细胞术，以帮助识别背景染色的来源。

9.考虑整合自动化自动化通过提高样品通量和提高实验一致性来补充多路复用的优势。它还降低了交叉污染的风险，有助于防止对身体的重复性劳损，并释放研究人员的时间用于其他任务。自动化选项包括可同时分配96个等分试样的多通道分配器，IHC染色系统和全自动免疫测定平台;这些都是值得考虑的，作为简化多路复用工作流程的策略。

10.使用高品质二抗产品进行多标记免疫测定可能让人无从下手，但JacksonImmunoResearch（一家为生命科学应用提供二抗的专业原始生产商）可以为您提供帮助。JIR公司提供与荧光蛋白（包括R-PE、APC和PerCP）和荧光染料（包括AlexaFluor、亮紫色和罗丹明红）偶联的二抗，以及亚类特异性二抗、交叉吸附二抗、生物素化二抗、并标记链霉亲和素。