HEK细胞是新药开发研究的主要细胞，本文初步介绍了细胞的瞬时转染技术并常用的结果分析方法：

HEKT贴壁细胞瞬时转染：

1.使用12.5mL培养基将HEKT细胞接种到10cm板中，以在日培养后达到70-80%的融合度。

2.为了提高转染和生产过程中的细胞粘附，用无菌聚L-赖氨酸0.01%(w/v)，75–kDa，细胞培养级）制备板15分钟，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS；mMNaCl、2.6mMKCl、8mMNa2HPO4、1.5mMKH2PO4）。

3.用10μg聚乙烯酰亚胺进行转染。将10μg高质量质粒DNA和80μg/mLPEI分别稀释在μLDMEM中。

4.将DNA和PEI溶液混合并在室温(RT)下孵育15-30分钟。DNA/PEI复合物分布在细胞上并孵育24小时。

5.第二天，培养基完全被补充有4%(v/v)IgG剥离FCS(PAA)和青霉素/链霉素的DMEM替代，以较大限度地减少蛋白质A/G亲和层析对牛IgG的共纯化。

6.通常每天收获和更换培养基长达两周。每天收获和更换生产培养基长达1-2周。

在悬浮HEK-6E细胞中瞬时转染和生产

1.在悬浮HEK细胞中进行瞬时生产。简而言之，转染前两天5×细胞/mLHEK-6E在25至mL无血清培养基（不含G）中接种到至mL带通气膜盖的聚碳酸酯锥形瓶中，并在37°C和rpm下孵育在轨道振动器中。

2.对于小规模生产，将12孔板中的1mL/孔在线性振荡器中以rpm的速度孵育。如果没有另外说明，应当在1/10体积的新鲜无血清培养基中制备总计1μg高质量质粒DNA和2.5μgPEI/mL培养体积。

3.量化编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或黄色荧光蛋白(YFP)变体venus的报告质粒pEF-FS-EGFP或pCS2-venus总DNA的1/20的转染效率，分别添加。

4.加入DNA/PEI复合物后，将细胞进一步培养48小时。然后按照其他方法与另外体积的新鲜培养基一起添加终了浓度为0.5%(w/v)的胰蛋白胨N1。

蛋白A纯化

所有scFv-hIgG1Fc抗体和scFv-hIgG1Fc-RNase构建体可使用1mLBio-ScaleMiniUNOsphereSUPrACartridges和Biorad的半自动Profinia2.0系统，根据标准制造商的方案通过蛋白A亲和纯化进行纯化。

流式细胞仪分析

通常在转染后48小时使用流式细胞仪来测量转染效率。通过荧光(FL)1中GFP（pTTo/GFPq、NRC、BRI；总质粒DNA的5%）或YFP的共表达来检测转染的细胞。用2μg/mL碘化丙啶对死细胞进行染色。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳((SDS-PAGE)

SDS-PAGE可以使用天能相关的试剂及电泳槽进行电泳分离。蛋白质标准品和样品在还原条件下用Laemmli样品缓冲液在95°C下制备5分钟，或在非还原条件下（不含还原剂的Laemmli样品缓冲液）在65°C下制备10分钟。使用SDS-PAGE进行凝胶电泳操作。然后进行考马斯染色。再通过IgG/Fc捕获ELISA和凝胶光密度法定量scFv-Fc抗体。

通过IgG/Fc捕获ELISA对生产上清液中的抗体进行定量的简要步骤如下：

1.共μL/孔山羊抗人免疫球蛋白（多价）捕获抗体（ng/mL）在PBS中稀释并包被在96孔微量滴定板中在37°C下1小时。

2.在37°C下用20%(v/v)FCS封闭1小时后，使用洗板器用PBST（含0.05%[v/v]tween-20的PBS）洗涤孔3次。

3.在含有1%(v/v)FCS的PBS中制备总共μL/孔的几种样品稀释液和半稀释系列的人IgG蛋白标准品，并在37℃孵育1小时。

4.洗涤后，将总共μL/孔的20ng/mL山羊抗人IgG（Fc特异性）抗体辣根过氧化物酶(HRP)偶联物在室温下孵育1小时。37℃。并通过添加μL/孔的0.5MH2SO4停止。

5.使用酶标仪在nm处针对nm的参考波长(A-A)测量吸光度。此外，在无血清培养条件下在HEK-6E细胞中产生的重组蛋白在考马斯染色后通过SDS-PAGE进行定量。在还原条件下制备样品，并使用分析软件与纯化的标准蛋白质进行比较。

代谢细胞培养参数的定量测量

用基于膜的酶分析仪对葡萄糖和L-乳酸进行定量。同时酶标仪也可用于测量L-谷氨酰胺与L-谷氨酸的组合。

HEK-6E中的瞬时表达与优化的表达载体和分批补料工艺相结合，可提供高达mg/L重组IgG样scFv-Fc抗体的稳健和多功能生产。该表达系统已被证明可以在摇瓶中从毫升扩展到升体积，这可以解决高通量体外抗体生成管道的生产瓶颈。此外，与小的重组抗体片段相比，更复杂的IgG样scFv-Fc抗体的高效分泌生产有助于下游加工并增加与标准免疫测定和其他应用的兼容性。#国产新冠疫苗做好大规模生产准备#