冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片，多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的,主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。冰冻切片之后如果不即时染色，可将片子放于负八十冰箱。再次取出后可先在室温晾干15分钟。然后置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；

　　用组化油笔将待染组织圈好，目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围，使抗体进行有效的孵育；

　　0.5%TritonX-(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）;用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干）封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景；

　　加入一抗(1:-1：)，4℃孵育过夜。一抗的浓度可以使用抗体的推荐浓度，或可根据抗体的质量选择合适的浓度；

　　固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、 　　

　　整个实验过程中勿使表面干燥。

　　稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。

　　冰冻切片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。

　　在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。