转印后，凝胶中的蛋白被固定在膜上。本文将介绍如何进行有效的目标蛋白检测，定性及定量样品中蛋白质与对应丰度。蛋白印迹检测使用针对目标蛋白具有特异性的一抗，最后再杂交酶或荧光分子标记的二抗，然后进行检测。正确选择、使用合适的一抗和二抗对于最大化信号，同时降低背景至关重要。蛋白上样内参的正确使用对于蛋白印迹的信号归一化也至关重要。我们会介绍检测膜上总蛋白的流行方法，以进行上样量控制，并对其优缺点进行说明。

免疫检测流程

1封闭膜上未结合蛋白部位

将膜在封闭液中孵育，封闭液用来遮盖膜上所有暴露位点，这些暴露位点会特异性的结合抗体，如未经行封闭，膜上会有极高的背景。

2一抗孵育，洗掉多余抗体

然后将膜与目标蛋白的一抗一起孵育。一抗会结合到目标蛋白上，然后将多余的抗体清洗掉。

3二抗孵育，洗掉多余抗体

然后将膜与二抗一起孵育，二抗会识别对应的一抗，该二抗标记有酶或荧光分子，最后清洗掉多余的二抗。

4产生信号

将膜与化学发光底物一起孵育，标记在二抗上的酶就会产生可检测到的光信号。如果二抗标记的是荧光染料，则可以行荧光成像仪中直接对膜进行成像，无需底物。

封闭

转印后，必须封闭膜上未占用的蛋白结合位点（未结合蛋白的位置），以防止膜对一抗的非特异性结合。如果不能完全封闭这些位点，则会导致膜的高背景，以及信号模糊。

有多种封闭液可供选择，没有一种封闭液对所有抗体/抗原组合都是最佳的选择。每个实验的最佳封闭液取决于抗体和膜的类型。可通过测试几种不同的封闭液效果，以优化方法，获得最低的背景。如Bio-Rad的EveryBlotBlockingBuffer等现代配方是比较通用的，可适用于多种目标蛋白、样品类型、膜种类和检测方法。

封闭时间也会影响信号和背景水平。通常封闭需持续1小时，过长的封闭时间可能反而会导致灵敏度降低，因为目标蛋白表位可能会被封闭液中的蛋白所掩盖，此外，目标蛋白也有可能会从膜上被冲走。相反，孵育时间不足会增加一抗的非特异性结合。Bio-Rad’sEveryBlotBlockingBuffer这样的先进配方封闭液可以在5分钟内完成封闭。为了检测磷酸化蛋白，封闭液中应不包含磷酸化的蛋白质，以避免高背景。避免使用脱脂奶粉，可使用BSA、酪蛋白或与磷酸化蛋白检测兼容的其他配方。

一抗

抗体是免疫球蛋白，例如IgG，是由于暴露于外源异物或抗原而产生的。抗体对引起其产生的对应抗原具有特异性的亲和力。针对于目标蛋白的一抗，用于选择性识别并结合已固定在膜上的目标蛋白。一抗可以设计成对目标蛋白的某些部分具有特异性，也可以设计为仅对某种修饰形式具有特异性。

选择一抗

一抗应具有特异性、高选择性，并能产生可重复的结果。为确保一抗的特异性，在进行免疫印迹分析时，务必使用阳性和阴性对照。作为阳性对照，可以使用纯化后的过表达目标蛋白或裂解物。阴性对照，可以选择仅包含二抗的对照（无一抗的孵育步骤）或明确不表达目标蛋白的组织或细胞裂解物，如经过基因敲除的细胞。在进行实验之前，请查阅文献以了解蛋白的表达特征。选择特异性磷酸化抗体时，至关重要的是确保只有目标蛋白在指定位点被磷酸化时，抗体才能特异性检测到这个蛋白。可能需要考虑使用诱导或抑制目标蛋白表达的生长因子/化合物来处理细胞。

一抗孵育

封闭后，将膜浸没在一抗溶液中孵育，通常使用封闭液稀释一抗。孵育时间和温度取决于抗体与靶蛋白的亲和力。孵育时间以室温下孵育1小时为起点。为减少背景，缓冲液中Tween20的使用量也很重要。

抗体浓度

最佳抗体浓度是指在没有背景或非特异性反应情况下，产生强阳性信号的抗体稀释度。从制造商处获得的抗体说明通常会建议抗体稀释范围。对于定制抗体或无建议稀释范围的抗体，通常尝试的起点是：

当一抗来源于血清或组织培养上清液时，1:–1:1,稀释

色谱纯化过的单克隆抗体，1:–1:10,稀释

当抗体来源于腹水时，1:1,–1:,稀释

二抗

二抗对一抗具有种属特异性。例如，山羊抗兔二抗是在山羊体内产生的针对兔一抗的抗体。二抗结合一抗上的许多不同保守区域，并起到放大信号的作用，从而提高检测灵敏度。二抗用酶进行比色或化学发光检测，或用荧光染料标记进行检测。

交叉吸附抗体

针对某物种的一抗所产生的二抗可以识别结合其他物种的一抗，特别是来自密切种属动物的一抗。例如，小鼠和大鼠抗体恒定区的一部分在进化上是保守的，出现了两个物种之间的保守表位。由于二抗通常是多克隆的，因此当产生针对小鼠的二抗时，这些二抗的一个子集将对那些保守表位具有特异性，无论这些表位位于小鼠还是大鼠抗体上，对应的二抗子集都能够识别它们。这种交叉反应在多重检测实验中可能会导致意想不到的条带，或高背景。

为了从多克隆库中除去不需要的抗体，可使用亲和色谱柱纯化交叉反应物种的二抗，去除识别某些抗原的克隆抗体。未结合的抗体库经过与色谱柱上固定的抗原交叉吸附后将不再具有结合活性。最常见的交叉吸附二抗通常是物种特异性的，这对于多重检测最有用；某些情况下也可使用同种型特异性抗体。如，可以用预先纯化过的IgG1去免疫动物，产生对IgG1有特异性反应的血清，从而得到与其他同种型抗体没有交叉反应的抗体。但是由于血清的多克隆性质，以及同种型之间某些表位的保守性，多克隆血清的成分可能会与IgG1上的表位反应，也有可能与IgG2a上的表位反应（如果也存在该表位），这仍然会影响二抗的同型特异性。

将针对小鼠IgG的二抗溶液通过含有固定的血清蛋白层析柱，该蛋白来自例如大鼠或兔子等存在潜在交叉反应的物种。只有对小鼠IgG具有高度特异性的抗体才会流穿色谱柱，而与大鼠或兔子蛋白发生交叉反应的抗体会结合并保留在色谱柱中。流穿溶液中含有可特异性识别小鼠IgG的抗体。

二抗浓度

与一抗相似，最佳抗体浓度是指在没有背景或非特异性反应的情况下，可产生强阳性信号的抗体稀释度。幸运的是，二抗的质量普遍较高，制造商也会建议稀释范围。

检测方法

过去，有很多不同的方法用于蛋白免疫印迹检测，但是现在绝大多数都使用酶促化学发光或荧光检测。因此，多数二抗都与酶（例如碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP））偶联，并与化学发光底物一起使用进行成像；或用荧光化合物标记二抗以进行荧光成像。

化学发光检测

ChemiluminescenceDetection

化学发光是一种化学反应，酶（通常是辣根过氧化物酶（HRP））催化化学底物（例如鲁米诺）的氧化反应，该氧化反应产生光作为副产物，光可由胶片或由数字成像仪捕获。

鲁米诺发光比较微弱，因此需要在反应体系中添加增强剂以增强信号，这种增强通常称为增强化学发光（ECL）。有许多种类的增强剂可用，其中一些可以将信号增强多达0倍，从而使ECL比其他常见的检测体系（如将底物转化为有色沉淀物）更加灵敏。光强度与目标蛋白量成大致比例关系，从而可以定量蛋白表达相对丰度。由于这种检测方法依赖于酶与底物的相互作用，因此反应动力学特征在信号的线性中起关键作用。为更准确地定量，必须注意确保样品量在测定的线性范围内，且检测信号未饱和。

荧光检测

FluorescenceDetectionforwesternblotting

在荧光检测中，一抗或二抗用荧光分子（染料或荧光基团）标记。使用特定波长光源激发荧光基团（激发光谱范围内），然后荧光基团发出更长波长的光子。激发光和发射光之间的波长差称为斯托克斯位移。然后可以通过适当设计的滤光片将较长波长的发射光与激发光区分开，并由数字成像仪进行检测。

荧光检测与传统化学发光检测相比具有许多优势。由于荧光检测不依赖于酶-底物反应，因此荧光基团的使用比化学发光检测更加定量、速度更快，也减少溶液使用。与化学发光相比，荧光免疫印迹检测的最大优势是能够使用多重荧光同时检测一张印迹膜上的多种蛋白。这取决于选择不同波长荧光基团标记，并且可以通过数字成像仪加以区分。

WesternBlotting检测技巧

使用高质量的一抗。

好的抗体敏感度高，意味着可以检测到更少量的靶蛋白；并且特异性高，只识别靶标蛋白，而不会产生伪条带。越来越多的抗体供应商提供已通过Westernblotting验证的抗体。

使用交叉吸附的二抗。

交叉吸附的抗体具有较低的交叉反应，减少背景，从而提供更可靠的结果。交叉吸附二抗容易从市场上买到，应尽量使用交叉吸附的二抗。

优化抗体浓度以获得最大信噪比。

目标蛋白灵敏取决于高信号和低背景。降低抗体浓度会降低信号值，也同时会降低背景；反之亦然。所以需要选择合适的抗体稀释度以确保在获得高信号的同时，也保持较低的背景。

对于多重检测，先要分别优化针对靶标蛋白的抗体。

同时检测多个目标时，请先分别进行每个目标蛋白的检测。这会简化所需要的故障排除步骤。

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