Cy5.5单琥珀酰亚基酯Cy5.5NHS酯背景：

多种花青5.5(Cy5.5)染料已用于标记生物分子，用于荧光成像和其他基于荧光的生化分析。它们广泛用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等。Cy5.5染料是最常见的红色荧光团之一。Cy5.5NHS酯很容易与氨基反应。AATBioquest提供三乙铵盐形式的Cy染料NHS酯，与其他一些供应商提供的相应钾盐相比，它们更易溶于DMSO和DMF。Cy染料三乙基铵盐具有相同的反应性，并得到与Cy染料钾盐相同的缀合物。Cy5.5是GEHealthcare的商标。

1.蛋白质原液（溶液A）

将L反应缓冲液（例如，1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH~9.0）与L目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度2mg/mL）混合，得到1mL蛋白质标记原液。注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1MpH9.0磷酸盐缓冲液将pH值调节到8.0-9.0的范围内。笔记：蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2-7.4。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须对1XPBS，pH7.2-7.4进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的抗体不会被很好地标记。叠丨氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除以获得最佳标记结果。笔记：如果蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议使用2-10mg/mL的最终蛋白质浓度范围。

2.花青5.5单琥珀酰亚胺酯原液（溶液B）

将无水DMSO添加到花青5.5单琥珀酰亚胺酯的小瓶中，制成10mM库存溶液。通过移液或涡旋充分混合。注意：在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）。及时使用。染料储备溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

艾美捷Cy5.5单琥珀酰亚基酯Cy5.5NHS酯示例实验协议：

该标记方案是为山羊抗小鼠IgG与花青5.5单琥珀酰亚胺酯的偶联物而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

艾美捷Cy5.5单琥珀酰亚基酯Cy5.5NHS酯运行偶联反应：

使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10:1摩尔比作为起点：将5L染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10mM）添加到蛋白质小瓶中溶液（95L溶液A），有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg/mL且蛋白质的分子量为~KD，则蛋白质的浓度为~0.05mM。注意：我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10:1摩尔比。如果太少或太高，分别确定J佳染料/蛋白质比例为5:1、15:1和20:1。

在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

以下方案是使用SephadexG-25柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例：

1.根据制造说明制备SephadexG-25色谱柱。

2.将反应混合物（从“运行共轭反应”）加载到SephadexG-25柱的顶部。

3.一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即添加PBS(pH7.2-7.4)。

4.向所需样品中添加更多PBS(pH7.2-7.4)以完成色谱柱纯化。将含有所需染料-蛋白质结合物的部分结合起来。注意：为了立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装以供多次使用。注意：为了长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。